首次发现新冠mRNA疫苗体内聚腺苷酸化，增长PolyA尾巴
尽管研发人员能够描绘出 mRNA 疫苗体内功能的大致路径，但整个 mRNA 疫苗领域仍处于探索阶段。体内 mRNA 的代谢过程，尤其是不同组织和细胞类型如何摄取 mRNA、mRNA 在体内细胞内的稳定性和代谢过程、翻译出的抗原如何诱导免疫反应等，我们了解有限。深入了解这些过程中的关键因子对提升 mRNA 疫苗的免疫效果至关重要。
特别是，关于 mRNA 疫苗体内 PolyA 尾巴的变化，目前几乎没有研究。获批上市的两款 mRNA 疫苗 mRNA-1273 和 BNT162b2 的 PolyA 尾巴组成和长度不同。BNT16b2 的 PolyA 尾巴包含 30 个 A、10 个其他核苷酸（GCAmψAmψGACmψ）和 70 个 A，而 mRNA-1273 的 PolyA 尾巴序列尚未公开。本文将探讨 mRNA-1273 进入体内后，PolyA 尾巴会发生怎样的变化。
首先，需要开发精确鉴定和识别 PolyA 尾巴的测序方法。纳米孔直接 RNA 测序技术（Direct RNA sequenceing, DRS）能够对 mRNA 进行直接测序，获取单个 mRNA 分子的碱基组成。在进行 RNA 测序时，马达蛋白控制 RNA 穿过纳米孔，不同碱基对离子流动造成的阻碍不同，通过分析电流波动信号识别并转换为碱基序列。
使用纳米孔测序方法分析 mRNA-1273 序列时，最大挑战在于序列读取。测序过程中，末端 mψ（假尿苷）会影响读取过程，导致序列准确度仅为参考序列的 74.1%。此外，需要特殊算法鉴定和测量 PolyA 尾巴长度。研究发现，mRNA-1273 的 PolyA 尾巴长度大致在 100 个 A 左右，并且在 PolyA 尾巴和接头序列之间存在一个意外的电流扰动信号，表明 mRNA-1273 末端存在一个独特的非腺苷酸序列。
在细胞水平上，mRNA-1273 的尾巴会发生快速变化。将 mRNA-1273-LNP 转染 HEK193T 细胞和 A549 细胞，经过 72 小时培养后，提取 Total RNA，采用 eDRS 纳米孔测序检测 mRNA-1273 的稳定性以及 PolyA 尾巴长度变化。结果显示，mRNA-1273 的尾巴快速移除末端 mψCmψAG，随后发生去腺苷酸反应，导致 PolyA 尾巴长度不断缩短。
体内 mRNA 的代谢受到多种因素影响。为了研究去腺苷酸反应与 RNA 降解的关系，研究人员在 HEK293T 细胞中敲除了 CNOT1 基因（主要去腺苷酸酶复合物 CCR4-NOT 的支架亚基），发现内源性转录本的 PolyA 长度增加，mRNA-1273 PolyA 尾巴长度缩短。然而，这一现象仅发生在缺乏末端 mψCmψAG 的 mRNA-1273，而完整末端的 mRNA-1273 PolyA 尾巴长度保持不变。
在体内环境中，mRNA-1273 的尾巴会经历不同变化。将 mRNA-1273 注射到小鼠体内后，提取注射位点组织中的 RNA，发现 mRNA-1273 会快速降解，在 24 小时后几乎检测不到。纳米孔测序显示，尽管存在一定程度的去腺苷酸化反应，但注射位点的绝大多数 mRNA-1273 末端含有 mψCmψAG 序列。有趣的是，存在数量的末端缺乏 mψCmψAG 的 mRNA-1273 PolyA 尾巴会延长至 150-200 A。
在巨噬细胞和 DCs 中，mRNA-1273 是否会发生聚腺苷酸化？采用纳米孔测序分析提取自骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和树突细胞（DCs）的 RNA，结果显示，在两种类型的细胞中，mRNA-1273 都很稳定，转染 72 小时后还能够检测到，转染 4 小时时，25% 的 mRNA-1273 还具备完整的 3' 末端。在巨噬细胞中，转染 24 小时后，mRNA-1273 PolyA 尾巴序列平均延长 20 A，能够增加至 200 A，到转染 72 小时后，PolyA 尾巴序列又回到初始的 100 A 左右。
研究人员进一步探讨了 mRNA-1273 发生重新聚腺苷酸化是由细胞内的哪个酶介导的。基因表达水平分析显示，在 mRNA-1273 注射位点和巨噬细胞中，与免疫反应和细胞激活相关的基因转录水平上调，而与基础代谢相关的基因转录水平下调。在巨噬细胞中，Tent5a 基因表达被诱导，而 Tent5c 基因表达水平很低。在 DCs 细胞中，Tent5a/5c 几乎没有表达。
通过纳米孔测序发现，在敲除 TENT5a 和 TENT5c 基因的巨噬细胞中，mRNA-1273 会更快速地降解和去聚腺苷酸化。这充分说明 TENT5A/C 在调控 mRNA-1273 PolyA 尾巴代谢方面起着关键作用。
研究还显示，TENT5A/C 的底物是内质网上的翻译产物，且在野生型巨噬细胞中，大部分增加的 PolyA 尾巴编码的内源性蛋白是在内质网上翻译的。共转染 mRNA-1273 和 Fluc-mRNA 到巨噬细胞，发现只有 mRNA-1273 的 PolyA 尾巴增加，而 Fluc-mRNA 的 PolyA 尾巴不会增加，这表明巨噬细胞中 TENT5 介导的提升 mRNA-1273 稳定性的过程在疫苗触发机体免疫反应中发挥着重要作用。
研究结论指出，首次对于 mRNA 疫苗进入体内后 PolyA 尾巴长度变化的研究发现，在巨噬细胞中，TENT5A 聚合酶将 mRNA-1273 重新聚腺苷酸化，增长 PolyA 尾巴，提升其稳定性，增强抗原表达和呈递，从而影响体液免疫反应的强度。为了增强 mRNA 疫苗的免疫或治疗效果，应建立纳米孔直接 RNA 测序平台（eDRS），分析组织和细胞中的 mRNA，并在 mRNA 疫苗生产过程中精确监控 PolyA 长度和 mRNA 序列。
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在体内，mRNA-1273 的降解和 polyA 尾巴的变化与细胞模型中的现象相似，尽管体内聚腺苷酸化反应的细节有待进一步探索。巨噬细胞和 DCs 细胞是 BNT162b2 的主要摄取细胞类型。研究发现，mRNA-1273 在这两种细胞中都有稳定的表达，但在转染后 24 小时时，mRNA-1273 聚腺苷酸化反应在巨噬细胞中表现出...
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首个新冠mRNA疫苗获批临床,是否意味着疫苗研发成功?
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2023诺贝尔生理学或医学奖——mRNA疫苗 详细介绍
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6月19日，中国首个新冠mRNA疫苗获批启动临床试验 。10月8日，中国同全球疫苗免疫联盟签署协议，正式加入“新冠肺炎疫苗实施计划” 。截至2021年2月25日，中国已经附条件上市的新冠疫苗已经达到4个，其中三个灭活疫苗，一个腺病毒载体疫苗 。截至3月27日24时，全国累计报告接种新冠病毒疫苗超过一亿剂次 。
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cho与mrna区别
cho与mrna有以下区别。1、重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)为重组亚单位疫苗，无病毒核酸成分，以新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)为靶点，通过重组表达RBD蛋白，诱导人体产生中和抗体，从而阻断新型冠状病毒与宿主细胞表面受体ACE2结合。2、mRNA是一种天然存在的分子，带有人类细胞的蓝图，可以产生靶标蛋白...
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三、mRNA递送挑战 mRNA链携带负电荷，难以穿过同样带负电荷的细胞膜，且自身脆弱，易被体内的多种酶降解。递送过程需克服两道屏障：酶降解和膜屏障。四、mRNA疫苗类别 自2019年新冠病毒大流行以来，mRNA疫苗成为热门研发方向。根据mRNA的不同结构和功能，可分为mRNA、bmRNA、saRNA三类。mRNA为常规、非...
首个新冠mRNA疫苗获批临床,临床试验行业有多艰辛?
6月25日消息由军事医学科学院和地方企业共同研制的新型冠状病毒候选基因疫苗(ARCoV)于6月19日获得国家药品监督管理局临床试验的正式批准。这是中国第一个批准用于临床试验的新冠疫苗。自肺炎爆发以来，军事科学院军事医学研究所开展了紧急科学研究，并通过多种技术途径促进了疫苗的研发。国产新冠疫苗是继重组...