外周血细胞分离的方法有哪些？分别如何操作 如何分离外周血单个核细胞
采集方法：外周血干细胞(PBSC)的采集方法与成分血的单采术类似，即用血细胞分离机分离采集外周血的单个核细胞组分。多采用分离淋巴细胞的程序分离。一般情况下行大静脉穿刺即可，外周静脉穿刺困难(尤其是小儿) 时需中心静脉穿刺。采集成人时的血流速度为5060m1／min，每次分离46循环(约34h)，分离血液的总容积9L，依据情况连续或隔日采集。对儿童采集时 的血流速度和分离的总容积依年龄和体重而定。
目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
方法:
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数
────────── × 104×2(稀释倍数)
4
6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
活细胞数
活细胞百分率＝────── ×100％
总细胞数
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。
1、自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的 和淋巴细胞，下层主 要为红细胞。此方法简便但各层中的细胞种类多，不纯。血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和少量红细胞。下层虽以红细胞为主，但 也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
2、差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细 胞分离开。其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两者易于分离开， 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。此法 分离的细胞纯度也不高。
3、氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂 解，以排除红细胞的干扰。另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。方法如下：
将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min离心20min，吸出上清血浆，将下层的红细胞、白细胞混合后，加入0.83 氯化铵，用量为血细胞悬液液量的3倍，于4℃作用20min后离心弃去上清。
在沉淀层中再加入新鲜0.83氯化铵混匀后于4℃作用20min，以便彻底清除红细胞，离心弃上清。
收货下层的细胞用PBS洗3次后，再用含5%人AB型血清的（含100U/ml卡拉霉素）培养基制成悬液，调整细胞浓度为（8-10）x10^9个/L，分瓶加塞在 37℃普通培养箱中旋转培养（12r/h）。
混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F）诱导22h，收货上清就可生产白细胞干扰素。此法分离的细胞纯度更差。
4、Ficoll分离法：
采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液，通过2000r/min离心后可使血细胞以不同相对密度分离开，如分离淋巴细胞可选用相对密度 1.077的分离液；若分离血小板可用相对密度1.090的分离液，若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度1.120的分离液，现以淋巴细胞分离为例，方法 如下。
取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液，用无钙、镁离子的PBS稀释3-4倍。
将Ficoll淋巴细胞分离液事先分装于离心管中，使其沉于管底，并在37℃中预热。
用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入，不让细胞悬液冲破分层液界面，使其悬于分层液上方。
以2000r/min离心20min后，不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上，由于红细胞在Ficoll作用下成串下沉，故在离心管中分布在Ficoll层下方，淋巴细胞分布在Ficoll层上方。
收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
此法分离获得淋巴细胞纯度高。
分离液的制备：9% Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份 混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于121℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。若配制高相对密度的分离液用加入高浓度 泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll来调整。
望采纳
外周血细胞分离的方法有：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分 离法、Ficoll分离法、阿法拉伐离心分离。
1、氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂 解，以排除红细胞的干扰。方法如下：
将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min离心20min，吸出上清血浆，将下层的红细胞、白细胞混合后，加入0.83 氯化铵，用量为血细胞悬液液量的3倍，于4℃作用20min后离心弃去上清。
在沉淀层中再加入新鲜0.83氯化铵混匀后于4℃作用20min，以便彻底清除红细胞，离心弃上清。
收货下层的细胞用PBS洗3次后，再用含5%人AB型血清的（含100U/ml卡拉霉素）培养基制成悬液，调整细胞浓度为（8-10）x10^9个/L，分瓶加塞在 37℃普通培养箱中旋转培养（12r/h）。
混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F）诱导22h，收货上清就可生产白细胞干扰素。此法分离的细胞纯度差。
2、Ficoll分离法：
采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液，通过2000r/min离心后可使血细胞以不同相对密度分离开，如分离淋巴细胞可选用相对密度 1.077的分离液；若分离血小板可用相对密度1.090的分离液，若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度1.120的分离液，现以淋巴细胞分离为例，方法 如下。
取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液，用无钙、镁离子的PBS稀释3-4倍。
将Ficoll淋巴细胞分离液事先分装于离心管中，使其沉于管底，并在37℃中预热。
用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入，不让细胞悬液冲破分层液界面，使其悬于分层液上方。
以2000r/min离心20min后，不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上，由于红细胞在Ficoll作用下成串下沉，故在离心管中分布在Ficoll层下方，淋巴细胞分布在Ficoll层上方。
收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
3、阿法拉伐离心分离
阿法拉伐(Alfa Laval)一次性连续流碟片离心机CultureOne™系列，可以帮助在分离过程中连续排出高浓度的细胞，提高离心液回收率和离心液透明度
特点:
CultureOne™系列全球首创适用于50L至2000L处理规模的一次性连续流离心机
即插即用的移动模块设计，无需工程配套，可在不同产线间灵活切换
全密闭下进料设计与固相连续带压排放，非常适合高固含量物料，保护细胞完整，得率高
无需进行CIP和SIP，极大缩短批次间切换时间，无蒸汽、水等工程配套，仅220V电源
，无菌快速对接，占地面积仅1平米多，在不同生产线间灵活切换转移。
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